Prinsip dasar isolasi plasmid

Metode isolasi DNA dari bakteri (plasmid) ini biasanya sering kita sebut miniprep yang singkatan dari mini-preparation. Ada pula yang mengatakan medi-prep. Apakah bedanya? Mini-prep maupun medi-prep sebenarnya metode yang digunakan sama, tetapi hanya jumlahnya volume saja yang beda. Kalau yang mini-prep small scale isolation of plasmid, sedangkan medi-prep adalah large-scale isolation of plasmid.

Yang saya akan tulis di sini adalah prinsip dasar isolasi DNA yang saya ambil dari Sambrook (buku Molecular Cloning). Isolasi DNA, bisa dengan cara manual (seperti yang saya tulis ini) dan bisa dengan menggunakan KIT. Menggunakan KIT, kita semua tahu bahwa akan memakan waktu yang lebih cepat dari yang manual, tapi akan lebih mahal karena buatan company. Tetapi sebenarnya prinsip dasar isolasi plasmid dengan KIT tersebut diambil dari buku Molecular Cloning ~ Sambrook.

Prinsipnya adalah pertama setelah kita kultur bakteri (biasanya menggunakan E.coli) selama semalam, kita sentrifuge yang gunanya adalah kita hanya mengambil kulturnya dan menghilangkan medium-nya. Setelahnya kita treatment dengan pemberian solution I, II, dan III. Solution ini semuanya adalah lysis buffer. Pada solution I kita bisa melihat komposisinya adalah glucose yang konsentrasinya tinggi. Seperti pada prinsip difusi-osmosis, jika ada larutan yang konsentrasi tinggi masuk dalam sel, dengan sendirinya membran sel akan rusak. Kemudian pemberian solution II yang harus fresh (NaOH dan SDS). Solution II ini kita menggunakan NaOH sebagai alkali, yang berfungsi merusak membran sel. Dan dalam step ini perlu kita ingat bahwa kita tidak boleh mem-vortex pada saat mix. Kalau kita vortex, semua akan hancur termasuk DNA-nya (NaOH adalah alkali kuat). solutiom NaOH dan SDS tidak untuk di-autoclaved maupun on ice, karena ada SDS-nya. SDS di sini adalah sabun yang juga untuk menghancurkan membran sel. Jadi bisa dilihat bahwa apalabila kita membuka tutup tube (pada saat akan memasukkan solution III), ada lendir-lendir di mulut tube. Itu menandakan bahwa membran sel telah lysis.  Sedangkan solution III berguna untuk neutralization, yang di situ dapat kita liat membran-membran yang telah lysis menggumpal dan menyatu. Nah, maka dari itu kita perlu sentrifuge untuk mengendapkan membran-membran yang lysis, sehingga yang kita ambil hanya supernatan (larutan bening ~ berisi DNA).

Setelahnya kita mendapatkan larutan bening itu, treatment dengan PCI (phenol : chloroform : isoamylalcohol), yang berfungsi untuk menghilangkan komponen-komponen lain dalam sel, misalnya protein. Karena target kita adalah mendapatkan DNA murni. Dan kita pun treatment dengan ethanol 100% dan NaAc (buffer). karena DNA ini tidak larut dalam ethanol, maka dengan pemberian ethanol kita akan melihat DNA di situ. NaAc sebagai garam/buffer berfungsi untuk membantu pengendapan. Sehingga proses ini kita dapat namakan ethanol presipitasi, yaitu penggendapan DNA dengan pemberian ethanol. Selain itu untuk membantu pengendapan, kita inkubasi di -20 derajat sekitar 1 jam, kemudian setelahnya sentrifuge dan washing dengan ethanol 70%, dry up dan pemberian TE. Pada dry up ini DNA harus benar-benar bersih dari ethanol, karena jika tidak bersih dari ethanol maka DNA tidak akan mau larut.

Setelahnya kita lakukan purifikasi. Purifikasi di sini bertujuan agar kita mendapatkan DNA yang benar-benar murni, tidak terkontaminasi dengan RNA. Bisa kita lihat pada step ini kita treatment dengan pemberian RNAse, supaya RNA yang terkontaminasi bisa hilang.

~ oleh adrianna pada November 29, 2009.

2 Tanggapan to “Prinsip dasar isolasi plasmid”

  1. Penjelasannya sangat membantu sekali, terima kasih.
    Saya izin untuk menyimpan file-nya..

  2. Untuk mengkonfirmasi keberhasilan dari plasmid apa yang harus dikerjakan dan tahapan apa lagi yang digunakan sehingga kita mendapatkan DNA rekombinan

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s

 
%d blogger menyukai ini: