Membuat cDNA Library ~ prinsip dasar

Pada dasarnya membuat cDNA Library (pustaka DNA) itu menggunakan mRNA. Jadi kita mengisolasi RNA terlebih dahulu dari sampel kita. RNA yang kita isolasi harus mengandung Poli (A)+ , jadi sebelum kita membuat cDNA Library hendaknya dicek terlebih dahulu dengan elektroforesis RNA (salah satu yang membedakan mRNA dengan RNA lain adalah mRNA memiliki Poli (A)+ ~ sekedar mengingatkan, mRNA hanya dipunyai oleh jasad tingkat tinggi). Dan satu hal lagi, pada saat kita kerja membuat cDNA, tidak boleh terkontaminasi oleh RNAse, karena RNAse dapat menghilangkan RNA sampel kita.

Supaya mempermudah dan hasilnya bagus, kita biasanya membuat cDNA dengan Kit (sudah disediakan dan dijual oleh pabrik). Di lab saya menggunakan produk TaKaRa cDNA synthesis kit manual (Cat #6130) dan TaKaRa cDNA PCR Library Kit manual (code #6119)

Dalam membuat cDNA (DNA komplemen) ada 2 step yang penting, yaitu membuat 1st strand cDNA dan 2nd strand cDNA.

Pada waktu pembuatan 1st cDNA, RNA harus dalam keadaan lurus. Maka dari itu biasanya sebelum dibuat proses pembuatan cDNA sintesis, RNA terlebih dahulu dipanaskan pada suhu 65 derajat, 5 menit, kemudian masukkan dalam es. cDNA disintesis dari mRNA dengan reverse transcriptase dan menggunakan oligo dT sebagai primer (2 komponen ini sangat penting dalam pembuatan 1st strand cDNA). Yang lainnya adalah buffer-buffer, seperti 1st strand synthesis buffer Dalam hal ini konsep yang dipakai adalah proses transkripsi pada DNA. Biasanya kita juga menyebutnya proses ini adalah RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR). Di sini juga kita inkubasi pada suhu yang berbeda. Pada kit yang saya pakai, (1) suhu ruang pada 10 menit (preinkubasi) ; (2) 42 derajat pada 1 jam (proses pembuatan cDNA) ; (3) 80 derajat pada 5 menit (mematikan reverse transkriptase).

Kemudian, proses selanjutnya adalah sintesis 2nd strand cDNA dari 1st cDNA yang telah terbentuk. Tapi sebelumnya ada proses penghancuran RNA (tapi RNA tidak hancur semua) dan meninggalkan potongan RNA kecil-kecil, oleh RNAse H. Potongan RNA kecil-kecil ini nantinya bisa dijadikan primer. Pada proses ini solution yang dibutuhkan adalah DNA polimerase untuk sintesis 2nd strand cDNA, RNA-se H (untuk memotong RNA), T4 DNA polimerase (untuk bluting / meratakan ujung DNA yang tidak rata. karena setelah dibentuk double-stranded DNA, kedua ujung cDNA tidak rata).

Setelahnya, dilakukan purifikasi cDNA dan ligation of cassette adaptor (jadi cDNA-nya dipasang adaptor).

 

~ oleh adrianna pada November 29, 2009.

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s

 
%d blogger menyukai ini: