UJI KETAHANAN BERBAGAI HIBRIDA TANAMAN KUBIS (Brassica oleracea cv. capitata L.) TERHADAP INFEKSI JAMUR PATOGEN

Y.Sri Wulan Manuhara¹⁾,Ni Nyoman Tri Puspaningsih²⁾,Sri Puji Astuti W.¹⁾,Widhi Dyah Sawitri.¹⁾

¹⁾Departemen Biologi Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga

²⁾Departemen Kimia Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga

——————————————————————————————————————————————-

ABSTRAK

Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan ketahanan berbagai hibrida tanaman kubis asal impor dan lokal terhadap infeksi jamur patogen dilihat dari besarnya nekrosis daun dan profil proteinnya. Sebagai bahan penelitian digunakan 6 jenis hibrida tanaman kubis yaitu hibrida K-K Cross, Ishito, Sinjuku, Gloria osena, Rotan osena, dan Investor, sedangkan jamur patogen yang digunakan adalah Penicillium sp., Mucor sp., Aspergillus sp dan Alternaria sp. Uji ketahanan dilakukan dengan cara menginokulasikan miselium-disk (diameter 5 mm) yang telah ditumbuhi jamur patogen di permukaan atas daun tanaman kubis. Tanaman kemudian dipelihara dalam keadaan lembap dan gelap. Tiga hari sesudah inokulasi diukur diameter nekrosis yang terjadi pada daun. Untuk mengetahui profil proteinnya dilakukan SDS-PAGE. Hasil penelitian menunjukkan tingkat ketahanan enam hibrida tanaman kubis terhadap infeksi berbagai macam jamur berbeda-beda, tetapi berdasarkan besarnya nekrosis akibat infeksi jamur diperoleh bahwa tanaman kubis lokal (Gloria osena, Rotan osena dan Investor) lebih tahan dibanding tanaman kubis impor (K-K Cross, Ishito, Sinjuku). Profil protein dari enam hibrida tanaman kubis yang digunakan dalam penelitian ini sama, yaitu terdiri dari enam pita dengan berat molekul 200 kDa, 150 kDa, 100 kDa, 50 kDa, 40 Da, 30 kDa. Di antara pita protein tersebut terdapat pita dengan berat molekul 33 kDa yang menunjukkan berat molekul dari protein enzim -1,3-endoglukanase.

Keywords: Brassica oleracea cv. capitata L., ketahanan tanaman, infeksi, jamur patogen

]]> http://biowidhi.wordpress.com/2008/07/23/20/feed/ 0 widhi http://biowidhi.wordpress.com/2008/07/23/my-script-english/ http://biowidhi.wordpress.com/2008/07/23/my-script-english/#comments Wed, 23 Jul 2008 12:40:43 +0000 biowidhi http://biowidhi.wordpress.com/?p=16 ]]>

Widhi Dyah Sawitri, 2008. Identification of β-1,3-endoglukanase Protein in Cabbage Cultivars (Brassica oleracea var. capitata L.) after Infected Some Pathogen Fungal. The Script is under guidance by Dr. Y. Sri Wulan Manuhara, M.Si and Dra. Sri Puji Astuti Wahyuningsih, M.Si. Department of Biology, Faculty of Science and Technology, Airlangga University.

—————————————————————————————————————————————–

ABSTRACT

Cabbage (Brassica oleracea var. capitata L.) is one of agricultural important crop that has some cultivars. Productivity of the crop is affected by some factors. One of disadvantage that can decrease the productivity is presence of disease caused by fungal pathogen infection. Some cabbage cultivars had been identified to possess defence system for pathogen infection. β-1,3-endoglukanase is one of enzyme which has a function to defence against pathogen fungal infection. This enzyme catalyzes the hydrolysis of β-1,3-glukan which is a major component of cell wall of most fungi and it has a molecule weight of 33 kDa. The hydrolyze yields elicitors and it then induces production of phytoalexins antifungal. This research was conducted for early identification of β-1,3-endoglukanase protein based on its molecular weight in SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphonat Polyacrylamide Gel Electrophoresis). The identification was carried out after cabbage cultivars (KK Cross, Gloria Osena, Ishito 3, Shinjuku, Rotan Osena, dan Investor 369) were infected by four fungal pathogens that are Penicillium sp., Mucor sp., Aspergillus sp., and Alternaria sp. One week after infection, the presence of necrotic on surface of leaves was observed. Result of necrotic observation showed that some of the cabbage cultivar was susceptible to the fungal pathogen infections, that were KK Cross and Shinjuku cultivars. However, Gloria Osena, Ishito 3, Rotan Osena, and Investor 369, were more resistance to fungal pathogen infection than KK Cross and Shinjuku. The SDS-PAGE analysis showed that the cultivars which were infected by Alternaria sp. and Aspergillus sp. could not produce β-1,3-endoglukanase protein band. These results showed that cabbage cultivars were susceptible when they were infected by Alternaria sp. and Aspergillus sp.

Keywords : β-1,3-endoglukanase, Brassica oleracea var. capitata L., pathogen fungal, necrotic, SDS-PAGE, resistance

Widhi Dyah Sawitri, 2008. Identifikasi Protein β-1,3-endoglukanase Berbagai Hibrida Tanaman Kubis (Brassica oleracea var. capitata L.) Setelah Diinfeksi Beberapa Jamur Patogen. Skripsi dibawah bimbingan Dr. Y. Sri Wulan Manuhara, M.Si dan Dra. Sri Puji Astuti Wahyuningsih, M.Si. Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga.

—————————————————————————————————————————————-

ABSTRAK

Tanaman kubis (Brassica oleracea var. capitata L.) merupakan salah satu jenis tanaman pertanian penting yang memiliki berbagai macam hibrida. Produksi tanaman kubis dipengaruhi oleh banyak faktor. Salah satu penyebab kerugian yang dapat menurunkan produktifitas tanaman kubis adalah adanya penyakit yang disebabkan oleh infeksi jamur patogen. Beberapa jenis tanaman kubis diketahui mempunyai sistem ketahanan terhadap serangan penyakit. β-1,3-endoglukanase merupakan salah satu enzim yang berfungsi sebagai sistem pertahanan melawan jamur patogen. Enzim ini mengkatalisis proses hidrolisis β-1,3-glukan yang merupakan komponen utama dinding sel jamur dan mempunyai berat molekul 33 kDa. Proses hidrolisis tersebut menghasilkan elisitor dan kemudian menginduksi terbentuknya fitoaleksin sebagai antifungi. Penelitian ini dilakukan untuk identifikasi awal keberadaan protein β-1,3-endoglukanase berdasar berat molekulnya menggunakan SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphonat Polyacrylamide Gel Electrophoresis). Identifikasi dilakukan setelah hibrida-hibrida tanaman kubis (KK Cross, Gloria Osena, Ishito 3, Shinjuku, Rotan Osena, dan Investor 369) masing-masing diinfeksi dengan empat jenis jamur patogen yaitu Penicillium sp., Mucor sp., Aspergillus sp., dan Alternaria sp. Seminggu setelah infeksi dilakukan pengamatan keberadaan nekrosis pada permukaan daun. Hasil pengamatan nekrosis menunjukkan bahwa beberapa hibrida tanaman kubis rentan terhadap infeksi jamur patogen, yaitu hibrida KK Cross dan Shinjuku. Sedangkan hibrida Gloria Osena, Ishito 3, Rotan Osena, dan Investor 369, ketahanan akibat infeksi jamur patogen dapat digolongkan lebih tinggi daripada KK Cross dan Shinjuku. Hasil analisis protein melalui SDS-PAGE diketahui bahwa hibrida yang diinfeksi oleh Alternaria sp. dan Aspergillus sp. tidak dapat memunculkan keberadaan protein β-1,3-endoglukanase, tetapi hibrida yang diinfeksi Penicillium sp., dan Mucor sp. menunjukkan keberadaan adanya protein β-1,3-endoglukanase. Hal ini menunjukkan bahwa tanaman kubis paling rentan jika diinfeksi dengan Alternaria sp. dan Aspergillus sp.

Kata kunci : β-1,3-endoglukanase, Brassica oleracea var. capitata L., jamur patogen, nekrosis, SDS-PAGE, ketahanan

]]> http://biowidhi.wordpress.com/2008/07/23/skripsi-saya-indonesian/feed/ 3 widhi http://biowidhi.wordpress.com/2008/04/26/happy-birthday-dna/ http://biowidhi.wordpress.com/2008/04/26/happy-birthday-dna/#comments Sat, 26 Apr 2008 02:11:11 +0000 biowidhi http://biowidhi.wordpress.com/?p=11 ]]>

Hari Jumat, 25 April, adalah hari ulang tahun ke-53 penemuan struktur Deoxyribonucleic Acid (DNA). Pada tanggal 25 April 1953 lalu, dua ilmuwan muda asal Amerika dan Inggris, James Watson dan Francis Crick mengumumkan proposal mereka mengenai struktur double helix DNA di jurnal ilmiah Nature.
Berikut adalah hal-hal menarik di  seputar penemuan ini : 

• Artikel mereka berjudul “Molecular Strucure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid”  dengan  panjang hanya satu halaman
• Manuskripnya diketik adik Watson, Betty.
• Artikel ini memakai hanya satu ilustrasi yang digambar oleh istri Crick, Odile
• cuma memakai enam daftar pustaka. 
• Artikel ini tidak terkenal sampai The News Chronicle of London, 15 Mei,  meliput kuliah Sir Lawrence Bragg (direktur Laboratorium Cavendish tempat Watson dan Crick mengerjakan riset ) di London.
• Walaupun Dr. Crick kemudian diwawancarai oleh BBC di musim gugur tahun itu, penemuan struktur double helix (spiral ganda) DNA itu hanya diberitakan sekedarnya saja setelah itu.
• Dr.Robert C. Olby (sejarawan di University of Pittsburgh) mengatakan bahwa di majalah Nature pada tahun yang sama, dari 20 artikel tentang DNA, hanya 7 yang menyebut double helix.
• Butuh waktu 10 tahun untuk Nobel atas struktur DNA ini.

- sumber : newsletter “Save Our Surrounding” HIMANBIO IPB 2008 -

Pada dasarnya sistem transkripsi maupun translasi pada prokariot maupun eukariot sama. Sama-sama memerlukan DNA templat, RNA polimerase, NTP (ribonukleotida) dan molekul protein regulator. Bahkan keduanya pula terdapat tahapan inisiasi, elongasi, dan terminasi. Tapi di sini saya akan menjelaskan lebih banyak tentang eukariot.

Pada proses transkripsi, perbedaan yang paling mendasar antara prokariot dan eukariot adalah tempatnya. Pada eukariot terdapat di inti sel dan pada prokariot di sitoplasma. Hal ini dikarenakan menurut struktur selnya, eukariot mempunyai membran inti dan prokariot tidak. Sehingga diketahui pula pada eukariot gen-gennya tersebar pada kromosom. Selain itu eukariot bersifat monosistronik, artinya satu transkrip yang dihasilkan hanya mengkode satu macam produk ekspresi. Sedangkan pada prokariot bersifat polysistronik yang dalam satu transkrip mengkode beberapa macam produk ekspresi. Pada struktur gen eukariot pun berseling-seling : Intron (sekuen mengkode tidak spesisifik) – Ekson (sekuen mengkode spesifik) – Intron, dan pada prokariot tidak. Produknya pun pada eukariot terdapat tiga macam RNA polimerase yaitu tRNA, rRNA, dan mRNA. Sedangkan pada prokariot menghasilkan produk satu macam RNA saja.

Pada proses inisiasi pada eukariot, tipe enzim RNA polimerase pada eukariota lebih kompleks. Dari 3 tipe enzim yang paling banyak dipelajari adalah polimerase yang akan menghasilkan mRNA. mRNA harus mengalami pemasakan terlebih dahulu yang melibatkan proses yang kompleks disebut prosesing. Prosesing meliputi penambahan ‘tudung’ pada ujung 5’ dan ‘ekor’ pada ujung 3’, dan pemotongan (splicing) hasil awal transkrip mRNA (pre-mRNA) berukuran sangat besar. Ada 3 elemen yang ditambahkan dalam polimerisasi tersebut, yaitu:

• TATA box (Goldberg-Hogness box)
Posisinya 30 pasang basa (pb) sebelum titik transkripsi (-30). Konsensus urutan ini adalah heptanukleotida (tersusun atas 7 nukleotida) yang hanya mengandung A dan T (TATAAAA). TATA box bertanggung jawab terhadap penempelan awal supaya terjadi denaturasi pita ganda DNA. Hal ini didukung oleh kenyataan bahwa pasangan A-T tidak sestabil pasangan G-C, karena pasangan A-T hanya mempunyai dua ikatan hidrogen dan G-C mempunyai tiga ikatan hidrogen.

• CAAT box
Terletak sebelum promoter, pada beberapa gen sekitar 80 nukleotida sebelum titik transkrip (-80). Urutan nukleotidanya adalah GGCCAATCT. CAAT bersama dengan TATA box mempengaruhi efisiensi promoter.

• DNA enhancer
Lokasinya bervariasi (jauh di hulu gen, sesudah gen, bahkan di dalam gen itu sendiri). Selain enhancer, elemen pengatur lain yang dapat mempengaruhi ekspresi suatu gen adalah silencer, yang dapat menghambat ekspresi suatu gen. Suatu elemen dapat bersifat sebagai enhancer maupun sebagai silencer, tergantung pada protein yang menempel. Contohnya saja sistem hormon tiroid, elemen yang menentukan tanggapan hormon tiroid akan bersifat sebagai silencer jika receptor hormon tiroid terikat pada elemen tersebut tanpa bersama-sama dengan ligannya (hormon tiroid).

• Faktor lain yang disebut trans-acting factors
Perlengkapan ini memfasilitasi penempelan (tahap inisiasi) trans-acting factor berupa protein, pada manusia faktor transkripsi ini diberi nama TFIIA, TFIIB, dst. Salah satu TF yaitu TFIID terikat pada TATA box disebut TATA-binding protein (TBP).

Pada proses translasi mRNA eukariota berumur lebih panjang (jam) dibanding mRNA prokariota (menit). Pada ujung 5’ mRNA eukariota ditambahkan ‘tudung’ yaitu 7-metilguanosin. Fungsi tudung ini adalah untuk efisiensi translasi. mRNA eukariota mempunyai urutan pengenal 5’-ACCAUGG disekitar kodon inisiasi AUG. Urutan ini disebut urutan Kozak (Marilyn Kozak). Pada prosesnya tidak memerlukan amino acid formylmethionine pada waktu inisiasi, tetapi kodon startnya tetap AUG, sehingga tRNA awal adalah tRNA-met. Faktor protein untuk inisiasi, elongasi dan terminasi sama dengan pada prokariota, tetapi jumlah yang diperlukan lebih banyak. Pada eukariota mempunyai ER. Struktur ER memungkinkan ribosom menyalurkan proein yang baru disintesis ke dalam saluran yang ada pada ER. Lain halnya dengan prokariot yang tidak mempunyai ER.

Yang dimaksud Dogma Central di sini adalah semua informasi terdapat pada DNA, kemudian akan digunakan untuk menghasilkan molekul RNA melalui transkripsi, dan sebagian informasi pada RNA tersebut akan digunakan untuk menghasilkan protein melalui proses yang disebut translasi.

Berikut adalah mekanisme prosesnya :

TRANSKRIPSI

Ini merupakan tahapan awal dalam proses sintesis protein yang nantinya proses tersebut akan berlanjut pada ekspresi sifat-sifat genetik yang muncul sebagai fenotip. Dan untuk mempelajari biologi molekuler tahap dasar yang harus kita ketahui adalah bagaimana mekanisme sintesis protein sehingge dapat terekspresi sebagai fenotip.

Transkripsi merupakan proses sintesis molekul RNA pada DNA templat. Proses ini terjadi pada inti sel (nukleus) tepatnya pada kromosom.
Komponen yang terlibat dalam proses transkripsi yaitu : DNA templat yang terdiri atas basa nukleotida Adenin (A), Guanin (G), Timin (T), Sitosin (S) ; enzim RNA polimerase ; faktor-faktor transkripsi, prekursor (bahan yang ditambahkan sebagai penginduksi).
Hasil dari proses sintesis tersebut adalah tiga macam RNA, yaitu mRNA messeger RNA), tRNA (transfer RNA), rRNA (ribosomal RNA).
Sebelum itu saya akan memaparkan terlebih dahulu bagian utama dari suatu gen. Gen terdiri atas : promoter, bagian struktural (terdiri dari gen yang mengkode suatu sifat yang akan diekspresikan), dan terminator.
Sedangkan struktur RNA polimerase terdiri atas : beta, beta-prime, alpha, sigma. Pada struktur beta dan beta-prime bertindak sebagai katalisator dalam transkripsi. Struktur sigma untuk mengarahkan agar RNA polimerase holoenzim hanya menempel pada promoter. Bagian yang disebut core enzim terdiri atas alpha, beta, dan beta-prime.

Tahapan dalam proses transkripsi pada dasarnya terdiri dari 3 tahap, yaitu :

1. Inisiasi (pengawalan)
Transkripsi tidak dimulai di sembarang tempat pada DNA, tapi di bagian hulu (upstream) dari gen yaitu promoter. Salah satu bagian terpenting dari promoter adalah kotak Pribnow (TATA box). Inisiasi dimulai ketika holoenzim RNA polimerase menempel pada promoter. Tahapannya dimulai dari pembentukan kompleks promoter tertutup, pembentukan kompleks promoter terbuka, penggabungan beberapa nukleotida awal, dan perubahan konformasi RNA polimerase karena struktur sigma dilepas dari kompleks holoenzim.

2. Elongasi (pemanjangan)
Proses selanjutnya adalah elongasi. Pemanjangan di sini adalah pemanjangan nukleotida. Setelah RNA polimerase menempel pada promoter maka enzim tersebut akan terus bergerak sepanjang molekul DNA, mengurai dan meluruskan heliks. Dalam pemanjangan, nukleotida ditambahkan secara kovalen pada ujung 3’ molekul RNA yang baru terbentuk. Misalnya nukleotida DNA cetakan A, maka nukleotida RNA yang ditambahkan adalah U, dan seterusnya. Laju pemanjangan maksimum molekul transkrip RNA berrkisar antara 30 – 60 nukleotida per detik. Kecepatan elongasi tidak konstan.

3. Terminasi (pengakhiran)
Terminasi juga tidak terjadi di sembarang tempat. Transkripsi berakhir ketika menemui nukleotida tertentu berupa STOP kodon. Selanjutnya RNA terlepas dari DNA templat menuju ribosom.

TRANSLASI

Tahap selanjutnya setelah transkripsi adalah translasi. Translasi merupakan suatu proses penerjemahan urutan nukleotida yang ada pada molekul mRNA menjadi rangkaian asam-asam amino yang menyusun suatu polipeptida atau protein.
Yang diperlukan dalam proses translasi adalah : mRNA, ribosom, tRNA, dan asam amino.
Sebelumnya saya terlebih dahulu akan menjelaskan tentang struktur ribosom. Ribosom terdiri atas subunit besar dan kecil. Bila kedua subunit digabung akan membentuk suatu monosom. Subunit kecil mengandung sisi Peptidil (P), dan Aminoasil (A). Sedangkan subunit besar mengandung Exit (E), P, dan A. Kedua subunit tersebut mengandung satu atau lebih molekul rRNA. rRNA sangat penting untuk mengidentifikasi bakteri pada tataran biologi molekuler, pada prokariot 16 S dan eukariot 18 S.

Seperti halnya transkripsi, pada translasi juga dibagi dalam tiga tahap :

1. Inisiasi
Pertama tRNA mengikat asam amino, dan hal ini menyebabkan tRNA teraktivasi atau peristiwa ini disebut amino-asilasi. Proses amino-asilasi ini dikatalisis oleh enzim tRNA sintetase. Kemudian ribosom mengalami pemisahan menjadi subunit besar dan kecil. Subunit kecil selajutnya melekat pada molekul mRNA dengan kodon awal tempat menempel : 5’ – AGGAGG – 3’. Urutan tempat menempelnya subunit kecil disebut urutan Shine-Dalgarno. Subunit kecil dapat menempel pada mRNA bila ada IF-3. Pembentukan kompleks IF-2/tRNA-fMet dan IF-3/mRNA-fMet disebut asam amino N-formilmetionin dan memerlukan banyak GTP sebagai sumber energi. tRNA-fMet kemudian menempel pada kodon pembuka P subunit kecil. Selanjutnya Subunit besar menempel pada subunit kecil. Pada proses ini IF-1 dan IF-2 dilepas dan GTP dihidrolisis menjadi GDP, dan siap melakukan elongasi.

2. Elongasi
Perbedaan pada proses transkripsi, pada translasi asam amino yang dipanjangkan. Tahapan yang dilakukan pada proses elongasi, pertama adalah pengikatan tRNA pada sisi A yang ada di ribosom. Pemidahan tersebut akan membentuk ikatan peptida.

3. Terminasi
Translasi akan berakhir pada waktu salah satu dari ketiga kodon terminasi (UAA, UGA, UAG) yang ada pada mRNA mencapai posisi A pada ribosom. Pada E. coli ketiga sinyal penghentian proses translasi tersebut dikenali oleh suatu protein yang disebut release factor (RF). Penempelan RF pada kodon terminasi tersebut mengaktifkan enzim peptidil transferase yang menghidrolisis ikatan antara polipeptida dng tRNA pada sisi P dan menyebabkan tRNA yang kosong mengalami translokasi ke sisi E (exit).

Itulah tadi mekanisme proses transkripsi maupun translasi. Proses selanjutnya adalah protein tersebut akan diekspresikan oleh tubuh kita dalam bentuk fenotip.

Analisis molekuler tersebut dapat berupa analisis asam nukleat maupun analisis protein. Di sini saya akan menjelaskan sekilas saja tentang beberapa metode dalam analisis molekuler, karena analisis lebih lanjut akan saya jelaskan secara spesifik lagi.

Beberapa metode analisis molekuler diantaranya adalah :
1. Proteomic
2. Immunohistokimia
3. Southern Blot
4. Northern Blot
5. Western Blot
6. Insituhibridization
7. Immunoflourescence
8. Apoptosis
9. PCR

Pada analisis asam nukleat yaitu utamanya adalah DNA, terdapat tiga macam analisis. Analisis pertama adalah analisis keberadaan (uji kualitatif) dengan metode insituhibridization. Metode tersebut pada prinsipnya adalah dihibridisasi dengan probe, yaitu hibridisasi DNA pada sayatan histologi metode parafin dengan menggunakan probe RNA. Mekanismenya kurang lebih suatu jaringan dihomogenkan – isolasi DNA – elektroforesis – dibloting ke dalam nitroselulose – dihibridisasi dengan RNA yang akan diukur – band hasil hibridisasi diukur kadarnya dengan densitometri. Analisis kedua adalah mengukur kadar dengan Southern Blot. Dan yang terakhir adalah sequensing nukleotida dengan menggunakan PCR.

Analisis asam nukleat selanjutnya adalah analisis RNA. RNA dalam hal ini adalah mRNA (mesegger RNA). Analisisnya ada dua yaitu, analisis secara kualitatif dengan insituhibridization dan analisis secara kuantitatif dengan Nouthern Blot.

Selain asam nukleat, metode analisis molekuler juga berlaku pada protein. Analisis pada protein diantaranya secara kualitatif dengan imunohistokimia dan imunoflourescence. Imunohistokimia di sini yang diuji adalah antigennya, dengan primernya adalah antibody. Begitu halnya untuk mengetahui lokalisasi protein dengan imunohistokimia dan imunoflourescence. Sedangkan analisis kuantitatif dengan menggunakan Western Blot. Dan yang terakhir sequencing asam amino dengan proteomic

What is molecular biology? Saya akan memberi gambaran sedikit pada anda apa itu biologi molekuler. Biologi molekuler adalah salah satu bentuk aplikasi dari ilmu biologi, khususnya bioteknologi. Yang dipelajari pada biologi molekuler di sini adalah sesuatu pada mahluk hidup pada tingkatan molekuler-nya, misalnya saja adalah asam nukleat yang meliputi DNA dan RNA, karbohidrat, lemak (lipid), dan protein. Tujuan dari kita mempelajari biologi molekuler adalah selain kita dapat memahami mekanisme yang terjadi dalam tubuh kita secara mendetail, kita juga dapat mengaplikasikannya dengan melakukan rekayasa genetika modern dan tentu saja hal itu dilakukan untuk meningkatkan kesejahteraan manusia. Misalnya dengan membuat tanaman transgenik, membuat vaksin dari suatu penyakit, dan masih banyak lagi. Biologi molekuler dewasa ini sedang dilakukan oleh negara-negara maju, dan memang pada kenyataannya ilmu ini sangat penting. Karena untuk mempelajari suatu mekanisme kehidupan biologi saat ini sudah mencapai pada tataran molekuler, bukan lagi jaringan atau seluler saja. Dengan mengutak-atik suatu gen tertentu, tanaman transgenik atau vaksin penyakit berbahaya dapat dibuat. Lalu apakah itu tidak melanggar etika? Hal ini memang sering sekali diperdebatkan. Dan saya rasa ada suatu kesalah pahaman di sini. Maksud saya adalah kebanyakan orang pasti akan berpikir kita nanti akan bisa membuat dinosaurus lagi atau membuat manusia dengan biologi molekuler. Hal ini mungkin saja terjadi secara teori. Akan tetapi pada kenyataanya hal ini sangat sulit terjadi. Jangankan kita membuat manusia, membuat satu sel hidup saja kita tidak mampu. Sejauh ini saja mikroba yang sudah kita ketahui urutan genetiknya adalah E.coli dan Bacillus. Dan sampai sejauh ini pula senyawa yang dapat kita buat secara sintetik (dalam skala pabrik) hanya sebatas amonia saja karena mempunyai struktur kimia sangat sederhana yaitu NH4. Padahal untuk membuat satu sel, harus ada DNA, RNA, protein, lipid, yang mempunyai struktur kimia yang sangat kompleks. Seperti pada teori pembentukan mahluk hidup, unsur yang paling penting dalam pembentukan mahluk hidup adalah C, H, O, N. Lalu bagaimana dengan domba dolly? Memang pada beberapa tahun yang lalu para ilmuwan telah dapat melakukan klonning domba yang diberi nama domba Dolly. Tetapi domba Dolly tidak dapat bertahan lama. Sehingga dari sini kita dapat mengetahui bahwa kemungkinan keberhasilan dari hasil klonning saat ini adalah sangat kecil. Jadi bisakah kita membuat manusia dengan mudah??? Masih banyak yang harus kita pelajari lebih lanjut, utamanya pada bidang biologi molekuler.

Bahasan yang akan saya paparkan di sini memang tidak termasuk dalam bidang biologi molekuler. Akan tetapi, ini adalah pengetahuan dasar yang harus kita ketahui apabila kita akan mengklon manusia misalnya. Karena dengan mengetahui proses fertilisasi, kita akan dapat memperkirakan bagian mana atau pada tahap apa kita dapat melakukan klon.

Fertilisasi adalah proses fusi atau peleburan spermatozoa dan ovum.

Sekedar informasi sebelum saya menjelaskan lebih lanjut adalah :

• Sperma manusia yang dikeluarkan saat ejakulasi sekitar 120 – 140 juta/ml.

• Pada manusia, ovum yang siap dimasuki spermatozoa pada saat pembelahan kromosom di dalam ovum mengalami metafase (pada meiosis I). Sebelum metafase sperma masih belum bisa masuk. Dan pada saat metafase, sperma baru bisa menempel pada ovum, kemudian spermatozoa memberi rangsangan pada ovum agar dapat masuk ke dalam ovum dan menyempurnakan prosesnya menjadi anafase, telofase, yang nantinya sperma akan bertemu dengan inti ovum.

• Fertilisasi hingga dapat menjadi suatu embrio harus dilakukan oleh satu sperma. Lebih dari satu sperma tidak dapat membuahi satu ovum. Apabila hal itu terjadi embrio tidak akan terbentuk dan mengalami degradasi. Mengapa hal itu terjadi? Kita akan mengetahuinya nanti.

Tahapan-tahapan yang terjadi pada fertilisasi adalah sebagai berikut :

Kapasitasi Spermatozoa dan Pematangan Spermatozoa
Kapasitasi Spermatozoa merupakan tahapan awal sebelum fertilisasi. Sperma yang dikeluarkan dalam tubuh (fresh ejaculate) belum dapat dikatakan fertil atau dapat membuahi ovum apabila belum terjadi proses kapasitasi. Proses ini ditandai pula dengan adanya perubahan protein pada seminal plasma, reorganisasi lipid dan protein membran plasma, Influx Ca, AMP meningkat, dan pH intrasel menurun.

Perlekatan spermatozoa dengan Zona Pelucida
Zona pelucida merupakan zona terluar dalam ovum. Syarat agar sperma dapat menempel pada zona pelucida adalah jumlah kromosom harus sama, baik sperma maupun ovum, karena hal ini menunjukkan salah satu ciri apabila keduanya adalah individu yang sejenis. Perlekatan sperma dan ovum dipengaruhi adanya reseptor pada sperma yaitu berupa protein. Sementara itu suatu glikoprotein pada zona pelucida berfungsi seperti reseptor sperma yaitu menstimulasi fusi membran plasma dengan membran akrosom (kepala anterior sperma) luar. Sehingga terjadi interaksi antara reseptor dan ligand. Hal ini terjadi pada spesies yang spesifik.

Reaksi Akrosom
Reaksi tersebut terjadi sebelum sperma masuk ke dalam ovum. Reaksi akrosom terjadi pada pangkal akrosom, karena pada lisosom anterior kepala sperma terdapat enzim digesti yang berfungsi penetrasi zona pelucida. Mekanismenya adalah reseptor pada sperma akan membuat lisosom dan inti keluar sehingga akan merusak zona pelucida. Reaksi tersebut menjadikan akrosom sperma hilang sehingga fusi sperma dan zona pelucida sukses.

Penetrasi Zona Pelucida
Setelah reaksi akrosom, proses selanjutnya adalah penetrasi zona pelucida yaitu proses dimana sperma menembus zona pelucida. Hal ini ditandai dengan adanya jembatan dan membentuk protein actin, kemudian inti sperma dapat masuk. Hal yang mempengaruhi keberhasilan proses ini adalah kekuatan ekor sperma (motilitas), dan kombinasi enzim akrosomal.

Bertemunya Sperma dan Oosit
Apabila sperma telah berhasil menembus zona pelucida, sperma akan menenempel pada membran oosit. Penempelan ini terjadi pada bagian posterior (post-acrosomal) di kepala sperma yang mnegandung actin. Molekul sperma yang berperan dalam proses tersebut adalah berupa glikoprotein, yang terdiri dari protein fertelin. Protein tersebut berfungsi untuk mengikat membran plasma oosit (membran fitelin), sehingga akan menginduksi terjadinya fusi.

Aktivasi Ovum Sebelum Sperma Bertemu Oosit
Ovum pada kondisi metafase sebelum bertemu dengan sperma harus diaktifkan terlebih dahulu. Faktor yang berpengaruh karena adanya aktivasi ovum adalah konsentrasi Ca, kelengkapan meiosis II, dan Cortical Reaction, yaitu reaksi yang terjadi pada ovum, eksosotosis, dan granula pendek setelah fusi antara sperma dan oosit.

Reaksi Zona untuk Menghadapi Sperma yang Masuk Setelah Penetrasi
Reaksi ini dikatalisis oleh protease yaitu mengubah struktur zona pelucida supaya dapat memblok sperma. Protein protease akan membuat zona pelucida mengeras dan menghambat sperma lain yang masuk zona pelucida. Melalui proses inilah ovum menyeleksi sperma dan hanya satu sperma yang masuk dalam ovum. Sehingga apabila sudah ada satu sperma yang masuk, dengan sendirinya ovum akan memblok sperma lain yang ingin masuk dalam ovum. Akan tetapi apabila ovum tidak dapat memblok sperma lain yang masuk, maka sperma yang masuk akan lebih dari satu. Hal ini menyebabkan rusaknya reseptor sperma dan kondisinya menjadi toxic sehingga akan terjadi gagal embrio. Keadaan seperti ini dinamakan Polyspermy.

Fertilisasi
Sperma dan ovum akhirnya berfusi dan fertilisasi terjadi. Akhir dari fertilisasi akan terbuntuk suatu zigot, embrio, kemudian individu baru.

Kurang lebih seperti itulah tahapan-tahapan dalam proses fertilisasi. Seperti yang saya katakan sebelumnya, ini adalah pengetahuan kita apabila ingin melakukan rakayasa genetika pada reproduksi manusia. Misalnya saja, saat ini telah ada teknologi bayi tabung, dimana prosesnya beracuan pada proses fertilisasi ini. Pada intinya teknologi bayi tabung bermula dari spermatid yang telah dewasa (dari epitel tubulus seminiferus) diambil sedikit kemudian diinjeksikan ke ovum langsung. Sehingga pada prosesnya tidak melalui fertilisasi yang panjang. Karena mungkin saja kondisi sperma tidak dapat melakukan tahapan-tahapan tersebut, atau karena adanya faktor lain yang mendukung sperma tersebut mati sebelum bertemu ovum. Kemudian, apabila pasangan suami-istri normal terjadi gagal embrio, mungkin saja terjadi polyspermy, dimana terdapat lebih dari satu sperma yang membuahi ovum.