sekilas tentang Poli (A)+

Poli (A)+ (Polyadenylation) biasanya ini menjadi ciri khas dari mRNA. Ini berguna pada saat kita ingin membuat cDNA library. Karena yang diperlukan untuk membuat cDNA library adalah mRNA. mRNA hanya dimiliki oleh jasad tingkat tinggi saja, misalnya tumbuhan, hewan, manusia.

RNA pada bagian ekornya mengandung basa A (adenin).  Poli (A)+ berfungsi menjaga RNA dari degradasi enzimatic di sitoplasma. Poli (A)+ bekerja dalam produksi RNA polimerase II (seperti percusor mRNA).

Keterangan lebih lengkap dapat dibaca di :

http://en.wikipedia.org/wiki/Polyadenylation

Prinsip dasar isolasi plasmid

Metode isolasi DNA dari bakteri (plasmid) ini biasanya sering kita sebut miniprep yang singkatan dari mini-preparation. Ada pula yang mengatakan medi-prep. Apakah bedanya? Mini-prep maupun medi-prep sebenarnya metode yang digunakan sama, tetapi hanya jumlahnya volume saja yang beda. Kalau yang mini-prep small scale isolation of plasmid, sedangkan medi-prep adalah large-scale isolation of plasmid.

Yang saya akan tulis di sini adalah prinsip dasar isolasi DNA yang saya ambil dari Sambrook (buku Molecular Cloning). Isolasi DNA, bisa dengan cara manual (seperti yang saya tulis ini) dan bisa dengan menggunakan KIT. Menggunakan KIT, kita semua tahu bahwa akan memakan waktu yang lebih cepat dari yang manual, tapi akan lebih mahal karena buatan company. Tetapi sebenarnya prinsip dasar isolasi plasmid dengan KIT tersebut diambil dari buku Molecular Cloning ~ Sambrook.

Prinsipnya adalah pertama setelah kita kultur bakteri (biasanya menggunakan E.coli) selama semalam, kita sentrifuge yang gunanya adalah kita hanya mengambil kulturnya dan menghilangkan medium-nya. Setelahnya kita treatment dengan pemberian solution I, II, dan III. Solution ini semuanya adalah lysis buffer. Pada solution I kita bisa melihat komposisinya adalah glucose yang konsentrasinya tinggi. Seperti pada prinsip difusi-osmosis, jika ada larutan yang konsentrasi tinggi masuk dalam sel, dengan sendirinya membran sel akan rusak. Kemudian pemberian solution II yang harus fresh (NaOH dan SDS). Solution II ini kita menggunakan NaOH sebagai alkali, yang berfungsi merusak membran sel. Dan dalam step ini perlu kita ingat bahwa kita tidak boleh mem-vortex pada saat mix. Kalau kita vortex, semua akan hancur termasuk DNA-nya (NaOH adalah alkali kuat). solutiom NaOH dan SDS tidak untuk di-autoclaved maupun on ice, karena ada SDS-nya. SDS di sini adalah sabun yang juga untuk menghancurkan membran sel. Jadi bisa dilihat bahwa apalabila kita membuka tutup tube (pada saat akan memasukkan solution III), ada lendir-lendir di mulut tube. Itu menandakan bahwa membran sel telah lysis.  Sedangkan solution III berguna untuk neutralization, yang di situ dapat kita liat membran-membran yang telah lysis menggumpal dan menyatu. Nah, maka dari itu kita perlu sentrifuge untuk mengendapkan membran-membran yang lysis, sehingga yang kita ambil hanya supernatan (larutan bening ~ berisi DNA).

Setelahnya kita mendapatkan larutan bening itu, treatment dengan PCI (phenol : chloroform : isoamylalcohol), yang berfungsi untuk menghilangkan komponen-komponen lain dalam sel, misalnya protein. Karena target kita adalah mendapatkan DNA murni. Dan kita pun treatment dengan ethanol 100% dan NaAc (buffer). karena DNA ini tidak larut dalam ethanol, maka dengan pemberian ethanol kita akan melihat DNA di situ. NaAc sebagai garam/buffer berfungsi untuk membantu pengendapan. Sehingga proses ini kita dapat namakan ethanol presipitasi, yaitu penggendapan DNA dengan pemberian ethanol. Selain itu untuk membantu pengendapan, kita inkubasi di -20 derajat sekitar 1 jam, kemudian setelahnya sentrifuge dan washing dengan ethanol 70%, dry up dan pemberian TE. Pada dry up ini DNA harus benar-benar bersih dari ethanol, karena jika tidak bersih dari ethanol maka DNA tidak akan mau larut.

Setelahnya kita lakukan purifikasi. Purifikasi di sini bertujuan agar kita mendapatkan DNA yang benar-benar murni, tidak terkontaminasi dengan RNA. Bisa kita lihat pada step ini kita treatment dengan pemberian RNAse, supaya RNA yang terkontaminasi bisa hilang.

Mini-preparation (isolation & purification plasmid) ~ from : Sambrook

Isolation of plasmid :

overnite culture cell (2 ml LB)
↓

12000 rpm, 5 min, 4oC
↓
take pellet
+ 100 ul solution I *
↓
vortex
↓
+ 200 ul solution II *
↓
swirling 6-8 x
↓
on ice 5 min
↓
+ 150 ul solution III *
↓
swirling 6-8 x
↓
on ice 5 min
↓

12000 rpm, 10 min, 4oC
↓
take supernatan
+ 400 ul PCI (Phenol : Chloroform : Isoamilalkohol = 25 : 24 : 1)
↓
vortex
↓

12000 rpm, 5 min, 4oC
↓
take supernatant (400 ul)
+ 2.5xvolume ethanol 100% (1 ml)
+ 0.1xvolume 3M Natrium Acetate (40 ul)
↓
mixed
↓
incubate -20oC, 1 h
↓

12000 rpm, 10 min, 4oC
↓
take pellet
+ 1 ml ethanol 70% cold
↓

12000 rpm, 10 min, 4oC
↓
take pellet
↓
dry up
↓
+ 25 ul TE or H2O

Purification of plasmid :
DNA (25 ul)
+ 5 ul RNAse A (0.1 ug/ul)
+ 20 ul ddH2O
↓
incubate 37oC, 1 h
↓
+ (PEG : NaCl)* : DNA
3 : 5
30 ul : 50 ul
↓
incubate 30 min, on ice
↓

10000 rpm, 10 min, 4oC
↓
take pellet
+ 1 ml ethanol 70% cold
↓

10000 rpm, 10 min, 4oC
↓
take pellet
↓
dry up
↓
+ 20 ul TE

 

* Solution I   : 50 mM glucose ; 25 mM Tris-Cl (pH.8) ; 10 mM EDTA (pH.8) ; autoclaved and keep on -20 degree celcius

* Solution II (make freshly) : 0.2 N NaOH ; 1% SDS

*  Solution III : 5 M Potassium Acetate (60 ml) ; glacial acetic (11.5 ml) ; H2O (28.5 ml)

* PEG : NaCl :  20% PEG 6000 ; 2.5 M NaCl ; autoclaved

cDNA Synthesis Protocol

(use : TaKaRa cDNA PCR Library Kit Code #6119 and cDNA Synthesis Kit Cat. #6130)

1st strand cDNA synthesis
1. Prepare Master Mix for 1st strand cDNA (always on ice) :

5 x 1st strand synthesis buffer (#6130) = 2 ul
dNTP mixture (#6130) = 0.5 ul
RNA-se inhibitor (#6130) = 0.5 ul
Oligo dT-RA primer (#6119) = 1 ul
M-MLV Reverse Transcriptase* (#6130) = 0.5 ul
____________________________________________
Total = 4.5 ul

2. Prepare template RNA :

1 ug RNA samples + DEPC water (#6130)  total volume = 5.5 ul
↓
heat at 65 oC , 5 min
↓
on ice
↓
add Master Mix (4.5 ul) to samples
↓
mix well
↓
put the samples on Thermal Condition

3. Thermal Condition :

Room temperature, 10 min
↓
42 oC, 1 h
↓
80 oC, 5 min

2nd strand cDNA synthesis

4. Prepare Master Mix for 2nd strand cDNA :

Reactan 1st strand cDNA = 10 ul
5 x 2nd strand synthesis buffer (#6130) = 15 ul
dNTP mixture (#6130) = 1.5 ul
DEPC water (#6130) = 44.5 ul
____________________________________________
Total = 71 ul

↓

5. Add E.coli DNA polymerase I (#6130) = 1 ul
6. Add E.coli RNAse H / DNA ligase mixture (#6130) = 1 ul

↓
Thermal Condition :
16 oC, 2 h
70 oC, 10 min
↓
Add T4 DNA polymerase I (#6130) = 2 ul
↓
incubate on 37 oC, 10 min
↓

Add Stop Solution (#6119) = 6 ul
↓
purification of 2nd strand cDNA

Purification of 2nd strand cDNA

Samples 2nd strand cDNA (81 ul)
+ PCI (25:24:1) equal volume (81 ul)
↓
mix well by vortex
↓

15000 rpm, 5 min, 4 oC
↓
take supernatant into new tube
+ CI (24:1) equal volume
↓
mix well by vortex
↓

15000 rpm, 5 min, 4 oC
↓
take supernatant into new tube
+ ammonium acetate 4M (#6119) equal volume
+ isopropanol equal volume
↓
keep on -20 oC, 1 h
↓
mix gently (no vortex)
↓

15000 rpm, 5 min, 4 oC
↓
take pellet
+ 1 ml 70% ethanol (washing)
↓

15000 rpm, 5 min, 4 oC
↓
dry up
↓
+ 5 ul DEPC water (#6130)
↓
ligation of Cassette Adaptor

Ligation of Cassette Adaptor
purification of 2nd strand cDNA samples
+ 2 ul CA (Cassette Adaptor) (#6119)
+ 6 ul ligation solution II
↓
mix well
↓
+ 12 ul ligation solution I
↓
mix well
↓
incubate on 16 oC, 30 min
↓
+ 25 ul ammonium acetate 4M (#6119) (equal volume)
+ 50 ul isopropanol (equal volume)
↓
keep on -20 oC, 30 min
↓

15000 rpm, 5 min, 4 oC
↓
take pellet
+ 1 ml 70% ethanol (washing)
↓

15000 rpm, 5 min, 4 oC
↓
dry up
↓
+ 30 ul DEPC water (#6130)
↓
keep on -20 oC

Membuat cDNA Library ~ prinsip dasar

Pada dasarnya membuat cDNA Library (pustaka DNA) itu menggunakan mRNA. Jadi kita mengisolasi RNA terlebih dahulu dari sampel kita. RNA yang kita isolasi harus mengandung Poli (A)+ , jadi sebelum kita membuat cDNA Library hendaknya dicek terlebih dahulu dengan elektroforesis RNA (salah satu yang membedakan mRNA dengan RNA lain adalah mRNA memiliki Poli (A)+ ~ sekedar mengingatkan, mRNA hanya dipunyai oleh jasad tingkat tinggi). Dan satu hal lagi, pada saat kita kerja membuat cDNA, tidak boleh terkontaminasi oleh RNAse, karena RNAse dapat menghilangkan RNA sampel kita.

Supaya mempermudah dan hasilnya bagus, kita biasanya membuat cDNA dengan Kit (sudah disediakan dan dijual oleh pabrik). Di lab saya menggunakan produk TaKaRa cDNA synthesis kit manual (Cat #6130) dan TaKaRa cDNA PCR Library Kit manual (code #6119)

Dalam membuat cDNA (DNA komplemen) ada 2 step yang penting, yaitu membuat 1st strand cDNA dan 2nd strand cDNA.

Pada waktu pembuatan 1st cDNA, RNA harus dalam keadaan lurus. Maka dari itu biasanya sebelum dibuat proses pembuatan cDNA sintesis, RNA terlebih dahulu dipanaskan pada suhu 65 derajat, 5 menit, kemudian masukkan dalam es. cDNA disintesis dari mRNA dengan reverse transcriptase dan menggunakan oligo dT sebagai primer (2 komponen ini sangat penting dalam pembuatan 1st strand cDNA). Yang lainnya adalah buffer-buffer, seperti 1st strand synthesis buffer Dalam hal ini konsep yang dipakai adalah proses transkripsi pada DNA. Biasanya kita juga menyebutnya proses ini adalah RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR). Di sini juga kita inkubasi pada suhu yang berbeda. Pada kit yang saya pakai, (1) suhu ruang pada 10 menit (preinkubasi) ; (2) 42 derajat pada 1 jam (proses pembuatan cDNA) ; (3) 80 derajat pada 5 menit (mematikan reverse transkriptase).

Kemudian, proses selanjutnya adalah sintesis 2nd strand cDNA dari 1st cDNA yang telah terbentuk. Tapi sebelumnya ada proses penghancuran RNA (tapi RNA tidak hancur semua) dan meninggalkan potongan RNA kecil-kecil, oleh RNAse H. Potongan RNA kecil-kecil ini nantinya bisa dijadikan primer. Pada proses ini solution yang dibutuhkan adalah DNA polimerase untuk sintesis 2nd strand cDNA, RNA-se H (untuk memotong RNA), T4 DNA polimerase (untuk bluting / meratakan ujung DNA yang tidak rata. karena setelah dibentuk double-stranded DNA, kedua ujung cDNA tidak rata).

Setelahnya, dilakukan purifikasi cDNA dan ligation of cassette adaptor (jadi cDNA-nya dipasang adaptor).

 

UJI KETAHANAN BERBAGAI HIBRIDA TANAMAN KUBIS (Brassica oleracea cv. capitata L.) TERHADAP INFEKSI JAMUR PATOGEN

Y.Sri Wulan Manuhara¹⁾,Ni Nyoman Tri Puspaningsih²⁾,Sri Puji Astuti W.¹⁾,Widhi Dyah Sawitri.¹⁾

¹⁾Departemen Biologi Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga

²⁾Departemen Kimia Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga

——————————————————————————————————————————————-

ABSTRAK

Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan ketahanan berbagai hibrida tanaman kubis asal impor dan lokal terhadap infeksi jamur patogen dilihat dari besarnya nekrosis daun dan profil proteinnya. Sebagai bahan penelitian digunakan 6 jenis hibrida tanaman kubis yaitu hibrida K-K Cross, Ishito, Sinjuku, Gloria osena, Rotan osena, dan Investor, sedangkan jamur patogen yang digunakan adalah Penicillium sp., Mucor sp., Aspergillus sp dan Alternaria sp. Uji ketahanan dilakukan dengan cara menginokulasikan miselium-disk (diameter 5 mm) yang telah ditumbuhi jamur patogen di permukaan atas daun tanaman kubis. Tanaman kemudian dipelihara dalam keadaan lembap dan gelap. Tiga hari sesudah inokulasi diukur diameter nekrosis yang terjadi pada daun. Untuk mengetahui profil proteinnya dilakukan SDS-PAGE. Hasil penelitian menunjukkan tingkat ketahanan enam hibrida tanaman kubis terhadap infeksi berbagai macam jamur berbeda-beda, tetapi berdasarkan besarnya nekrosis akibat infeksi jamur diperoleh bahwa tanaman kubis lokal (Gloria osena, Rotan osena dan Investor) lebih tahan dibanding tanaman kubis impor (K-K Cross, Ishito, Sinjuku). Profil protein dari enam hibrida tanaman kubis yang digunakan dalam penelitian ini sama, yaitu terdiri dari enam pita dengan berat molekul 200 kDa, 150 kDa, 100 kDa, 50 kDa, 40 Da, 30 kDa. Di antara pita protein tersebut terdapat pita dengan berat molekul 33 kDa yang menunjukkan berat molekul dari protein enzim -1,3-endoglukanase.

Keywords: Brassica oleracea cv. capitata L., ketahanan tanaman, infeksi, jamur patogen

My Script (English)

Widhi Dyah Sawitri, 2008. Identification of β-1,3-endoglukanase Protein in Cabbage Cultivars (Brassica oleracea var. capitata L.) after Infected Some Pathogen Fungal. The Script is under guidance by Dr. Y. Sri Wulan Manuhara, M.Si and Dra. Sri Puji Astuti Wahyuningsih, M.Si. Department of Biology, Faculty of Science and Technology, Airlangga University.

—————————————————————————————————————————————–

ABSTRACT

Cabbage (Brassica oleracea var. capitata L.) is one of agricultural important crop that has some cultivars. Productivity of the crop is affected by some factors. One of disadvantage that can decrease the productivity is presence of disease caused by fungal pathogen infection. Some cabbage cultivars had been identified to possess defence system for pathogen infection. β-1,3-endoglukanase is one of enzyme which has a function to defence against pathogen fungal infection. This enzyme catalyzes the hydrolysis of β-1,3-glukan which is a major component of cell wall of most fungi and it has a molecule weight of 33 kDa. The hydrolyze yields elicitors and it then induces production of phytoalexins antifungal. This research was conducted for early identification of β-1,3-endoglukanase protein based on its molecular weight in SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphonat Polyacrylamide Gel Electrophoresis). The identification was carried out after cabbage cultivars (KK Cross, Gloria Osena, Ishito 3, Shinjuku, Rotan Osena, dan Investor 369) were infected by four fungal pathogens that are Penicillium sp., Mucor sp., Aspergillus sp., and Alternaria sp. One week after infection, the presence of necrotic on surface of leaves was observed. Result of necrotic observation showed that some of the cabbage cultivar was susceptible to the fungal pathogen infections, that were KK Cross and Shinjuku cultivars. However, Gloria Osena, Ishito 3, Rotan Osena, and Investor 369, were more resistance to fungal pathogen infection than KK Cross and Shinjuku. The SDS-PAGE analysis showed that the cultivars which were infected by Alternaria sp. and Aspergillus sp. could not produce β-1,3-endoglukanase protein band. These results showed that cabbage cultivars were susceptible when they were infected by Alternaria sp. and Aspergillus sp.

Keywords : β-1,3-endoglukanase, Brassica oleracea var. capitata L., pathogen fungal, necrotic, SDS-PAGE, resistance

Skripsi saya (Indonesian)

Widhi Dyah Sawitri, 2008. Identifikasi Protein β-1,3-endoglukanase Berbagai Hibrida Tanaman Kubis (Brassica oleracea var. capitata L.) Setelah Diinfeksi Beberapa Jamur Patogen. Skripsi dibawah bimbingan Dr. Y. Sri Wulan Manuhara, M.Si dan Dra. Sri Puji Astuti Wahyuningsih, M.Si. Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga.

—————————————————————————————————————————————-

ABSTRAK

Tanaman kubis (Brassica oleracea var. capitata L.) merupakan salah satu jenis tanaman pertanian penting yang memiliki berbagai macam hibrida. Produksi tanaman kubis dipengaruhi oleh banyak faktor. Salah satu penyebab kerugian yang dapat menurunkan produktifitas tanaman kubis adalah adanya penyakit yang disebabkan oleh infeksi jamur patogen. Beberapa jenis tanaman kubis diketahui mempunyai sistem ketahanan terhadap serangan penyakit. β-1,3-endoglukanase merupakan salah satu enzim yang berfungsi sebagai sistem pertahanan melawan jamur patogen. Enzim ini mengkatalisis proses hidrolisis β-1,3-glukan yang merupakan komponen utama dinding sel jamur dan mempunyai berat molekul 33 kDa. Proses hidrolisis tersebut menghasilkan elisitor dan kemudian menginduksi terbentuknya fitoaleksin sebagai antifungi. Penelitian ini dilakukan untuk identifikasi awal keberadaan protein β-1,3-endoglukanase berdasar berat molekulnya menggunakan SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphonat Polyacrylamide Gel Electrophoresis). Identifikasi dilakukan setelah hibrida-hibrida tanaman kubis (KK Cross, Gloria Osena, Ishito 3, Shinjuku, Rotan Osena, dan Investor 369) masing-masing diinfeksi dengan empat jenis jamur patogen yaitu Penicillium sp., Mucor sp., Aspergillus sp., dan Alternaria sp. Seminggu setelah infeksi dilakukan pengamatan keberadaan nekrosis pada permukaan daun. Hasil pengamatan nekrosis menunjukkan bahwa beberapa hibrida tanaman kubis rentan terhadap infeksi jamur patogen, yaitu hibrida KK Cross dan Shinjuku. Sedangkan hibrida Gloria Osena, Ishito 3, Rotan Osena, dan Investor 369, ketahanan akibat infeksi jamur patogen dapat digolongkan lebih tinggi daripada KK Cross dan Shinjuku. Hasil analisis protein melalui SDS-PAGE diketahui bahwa hibrida yang diinfeksi oleh Alternaria sp. dan Aspergillus sp. tidak dapat memunculkan keberadaan protein β-1,3-endoglukanase, tetapi hibrida yang diinfeksi Penicillium sp., dan Mucor sp. menunjukkan keberadaan adanya protein β-1,3-endoglukanase. Hal ini menunjukkan bahwa tanaman kubis paling rentan jika diinfeksi dengan Alternaria sp. dan Aspergillus sp.

Kata kunci : β-1,3-endoglukanase, Brassica oleracea var. capitata L., jamur patogen, nekrosis, SDS-PAGE, ketahanan

Happy Birthday DNA…

Hari Jumat, 25 April, adalah hari ulang tahun ke-53 penemuan struktur Deoxyribonucleic Acid (DNA). Pada tanggal 25 April 1953 lalu, dua ilmuwan muda asal Amerika dan Inggris, James Watson dan Francis Crick mengumumkan proposal mereka mengenai struktur double helix DNA di jurnal ilmiah Nature.
Berikut adalah hal-hal menarik di  seputar penemuan ini : 

• Artikel mereka berjudul “Molecular Strucure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid”  dengan  panjang hanya satu halaman
• Manuskripnya diketik adik Watson, Betty.
• Artikel ini memakai hanya satu ilustrasi yang digambar oleh istri Crick, Odile
• cuma memakai enam daftar pustaka. 
• Artikel ini tidak terkenal sampai The News Chronicle of London, 15 Mei,  meliput kuliah Sir Lawrence Bragg (direktur Laboratorium Cavendish tempat Watson dan Crick mengerjakan riset ) di London.
• Walaupun Dr. Crick kemudian diwawancarai oleh BBC di musim gugur tahun itu, penemuan struktur double helix (spiral ganda) DNA itu hanya diberitakan sekedarnya saja setelah itu.
• Dr.Robert C. Olby (sejarawan di University of Pittsburgh) mengatakan bahwa di majalah Nature pada tahun yang sama, dari 20 artikel tentang DNA, hanya 7 yang menyebut double helix.
• Butuh waktu 10 tahun untuk Nobel atas struktur DNA ini.

- sumber : newsletter “Save Our Surrounding” HIMANBIO IPB 2008 -

Ekspresi gen pada Eukariot

Pada dasarnya sistem transkripsi maupun translasi pada prokariot maupun eukariot sama. Sama-sama memerlukan DNA templat, RNA polimerase, NTP (ribonukleotida) dan molekul protein regulator. Bahkan keduanya pula terdapat tahapan inisiasi, elongasi, dan terminasi. Tapi di sini saya akan menjelaskan lebih banyak tentang eukariot.

Pada proses transkripsi, perbedaan yang paling mendasar antara prokariot dan eukariot adalah tempatnya. Pada eukariot terdapat di inti sel dan pada prokariot di sitoplasma. Hal ini dikarenakan menurut struktur selnya, eukariot mempunyai membran inti dan prokariot tidak. Sehingga diketahui pula pada eukariot gen-gennya tersebar pada kromosom. Selain itu eukariot bersifat monosistronik, artinya satu transkrip yang dihasilkan hanya mengkode satu macam produk ekspresi. Sedangkan pada prokariot bersifat polysistronik yang dalam satu transkrip mengkode beberapa macam produk ekspresi. Pada struktur gen eukariot pun berseling-seling : Intron (sekuen mengkode tidak spesisifik) – Ekson (sekuen mengkode spesifik) – Intron, dan pada prokariot tidak. Produknya pun pada eukariot terdapat tiga macam RNA polimerase yaitu tRNA, rRNA, dan mRNA. Sedangkan pada prokariot menghasilkan produk satu macam RNA saja.

Pada proses inisiasi pada eukariot, tipe enzim RNA polimerase pada eukariota lebih kompleks. Dari 3 tipe enzim yang paling banyak dipelajari adalah polimerase yang akan menghasilkan mRNA. mRNA harus mengalami pemasakan terlebih dahulu yang melibatkan proses yang kompleks disebut prosesing. Prosesing meliputi penambahan ‘tudung’ pada ujung 5’ dan ‘ekor’ pada ujung 3’, dan pemotongan (splicing) hasil awal transkrip mRNA (pre-mRNA) berukuran sangat besar. Ada 3 elemen yang ditambahkan dalam polimerisasi tersebut, yaitu:

• TATA box (Goldberg-Hogness box)
Posisinya 30 pasang basa (pb) sebelum titik transkripsi (-30). Konsensus urutan ini adalah heptanukleotida (tersusun atas 7 nukleotida) yang hanya mengandung A dan T (TATAAAA). TATA box bertanggung jawab terhadap penempelan awal supaya terjadi denaturasi pita ganda DNA. Hal ini didukung oleh kenyataan bahwa pasangan A-T tidak sestabil pasangan G-C, karena pasangan A-T hanya mempunyai dua ikatan hidrogen dan G-C mempunyai tiga ikatan hidrogen.

• CAAT box
Terletak sebelum promoter, pada beberapa gen sekitar 80 nukleotida sebelum titik transkrip (-80). Urutan nukleotidanya adalah GGCCAATCT. CAAT bersama dengan TATA box mempengaruhi efisiensi promoter.

• DNA enhancer
Lokasinya bervariasi (jauh di hulu gen, sesudah gen, bahkan di dalam gen itu sendiri). Selain enhancer, elemen pengatur lain yang dapat mempengaruhi ekspresi suatu gen adalah silencer, yang dapat menghambat ekspresi suatu gen. Suatu elemen dapat bersifat sebagai enhancer maupun sebagai silencer, tergantung pada protein yang menempel. Contohnya saja sistem hormon tiroid, elemen yang menentukan tanggapan hormon tiroid akan bersifat sebagai silencer jika receptor hormon tiroid terikat pada elemen tersebut tanpa bersama-sama dengan ligannya (hormon tiroid).

• Faktor lain yang disebut trans-acting factors
Perlengkapan ini memfasilitasi penempelan (tahap inisiasi) trans-acting factor berupa protein, pada manusia faktor transkripsi ini diberi nama TFIIA, TFIIB, dst. Salah satu TF yaitu TFIID terikat pada TATA box disebut TATA-binding protein (TBP).

Pada proses translasi mRNA eukariota berumur lebih panjang (jam) dibanding mRNA prokariota (menit). Pada ujung 5’ mRNA eukariota ditambahkan ‘tudung’ yaitu 7-metilguanosin. Fungsi tudung ini adalah untuk efisiensi translasi. mRNA eukariota mempunyai urutan pengenal 5’-ACCAUGG disekitar kodon inisiasi AUG. Urutan ini disebut urutan Kozak (Marilyn Kozak). Pada prosesnya tidak memerlukan amino acid formylmethionine pada waktu inisiasi, tetapi kodon startnya tetap AUG, sehingga tRNA awal adalah tRNA-met. Faktor protein untuk inisiasi, elongasi dan terminasi sama dengan pada prokariota, tetapi jumlah yang diperlukan lebih banyak. Pada eukariota mempunyai ER. Struktur ER memungkinkan ribosom menyalurkan proein yang baru disintesis ke dalam saluran yang ada pada ER. Lain halnya dengan prokariot yang tidak mempunyai ER.