sekilas tentang Poli (A)+

•November 29, 2009 • 2 Komentar

Poli (A)+ (Polyadenylation) biasanya ini menjadi ciri khas dari mRNA. Ini berguna pada saat kita ingin membuat cDNA library. Karena yang diperlukan untuk membuat cDNA library adalah mRNA. mRNA hanya dimiliki oleh jasad tingkat tinggi saja, misalnya tumbuhan, hewan, manusia.

RNA pada bagian ekornya mengandung basa A (adenin).  Poli (A)+ berfungsi menjaga RNA dari degradasi enzimatic di sitoplasma. Poli (A)+ bekerja dalam produksi RNA polimerase II (seperti percusor mRNA).

Keterangan lebih lengkap dapat dibaca di :

http://en.wikipedia.org/wiki/Polyadenylation

Prinsip dasar isolasi plasmid

•November 29, 2009 • 2 Komentar

Metode isolasi DNA dari bakteri (plasmid) ini biasanya sering kita sebut miniprep yang singkatan dari mini-preparation. Ada pula yang mengatakan medi-prep. Apakah bedanya? Mini-prep maupun medi-prep sebenarnya metode yang digunakan sama, tetapi hanya jumlahnya volume saja yang beda. Kalau yang mini-prep small scale isolation of plasmid, sedangkan medi-prep adalah large-scale isolation of plasmid.

Yang saya akan tulis di sini adalah prinsip dasar isolasi DNA yang saya ambil dari Sambrook (buku Molecular Cloning). Isolasi DNA, bisa dengan cara manual (seperti yang saya tulis ini) dan bisa dengan menggunakan KIT. Menggunakan KIT, kita semua tahu bahwa akan memakan waktu yang lebih cepat dari yang manual, tapi akan lebih mahal karena buatan company. Tetapi sebenarnya prinsip dasar isolasi plasmid dengan KIT tersebut diambil dari buku Molecular Cloning ~ Sambrook.

Prinsipnya adalah pertama setelah kita kultur bakteri (biasanya menggunakan E.coli) selama semalam, kita sentrifuge yang gunanya adalah kita hanya mengambil kulturnya dan menghilangkan medium-nya. Setelahnya kita treatment dengan pemberian solution I, II, dan III. Solution ini semuanya adalah lysis buffer. Pada solution I kita bisa melihat komposisinya adalah glucose yang konsentrasinya tinggi. Seperti pada prinsip difusi-osmosis, jika ada larutan yang konsentrasi tinggi masuk dalam sel, dengan sendirinya membran sel akan rusak. Kemudian pemberian solution II yang harus fresh (NaOH dan SDS). Solution II ini kita menggunakan NaOH sebagai alkali, yang berfungsi merusak membran sel. Dan dalam step ini perlu kita ingat bahwa kita tidak boleh mem-vortex pada saat mix. Kalau kita vortex, semua akan hancur termasuk DNA-nya (NaOH adalah alkali kuat). solutiom NaOH dan SDS tidak untuk di-autoclaved maupun on ice, karena ada SDS-nya. SDS di sini adalah sabun yang juga untuk menghancurkan membran sel. Jadi bisa dilihat bahwa apalabila kita membuka tutup tube (pada saat akan memasukkan solution III), ada lendir-lendir di mulut tube. Itu menandakan bahwa membran sel telah lysis.  Sedangkan solution III berguna untuk neutralization, yang di situ dapat kita liat membran-membran yang telah lysis menggumpal dan menyatu. Nah, maka dari itu kita perlu sentrifuge untuk mengendapkan membran-membran yang lysis, sehingga yang kita ambil hanya supernatan (larutan bening ~ berisi DNA).

Setelahnya kita mendapatkan larutan bening itu, treatment dengan PCI (phenol : chloroform : isoamylalcohol), yang berfungsi untuk menghilangkan komponen-komponen lain dalam sel, misalnya protein. Karena target kita adalah mendapatkan DNA murni. Dan kita pun treatment dengan ethanol 100% dan NaAc (buffer). karena DNA ini tidak larut dalam ethanol, maka dengan pemberian ethanol kita akan melihat DNA di situ. NaAc sebagai garam/buffer berfungsi untuk membantu pengendapan. Sehingga proses ini kita dapat namakan ethanol presipitasi, yaitu penggendapan DNA dengan pemberian ethanol. Selain itu untuk membantu pengendapan, kita inkubasi di -20 derajat sekitar 1 jam, kemudian setelahnya sentrifuge dan washing dengan ethanol 70%, dry up dan pemberian TE. Pada dry up ini DNA harus benar-benar bersih dari ethanol, karena jika tidak bersih dari ethanol maka DNA tidak akan mau larut.

Setelahnya kita lakukan purifikasi. Purifikasi di sini bertujuan agar kita mendapatkan DNA yang benar-benar murni, tidak terkontaminasi dengan RNA. Bisa kita lihat pada step ini kita treatment dengan pemberian RNAse, supaya RNA yang terkontaminasi bisa hilang.

Mini-preparation (isolation & purification plasmid) ~ from : Sambrook

•November 29, 2009 • Tinggalkan sebuah Komentar

Isolation of plasmid :

overnite culture cell (2 ml LB)

12000 rpm, 5 min, 4oC

take pellet
+ 100 ul solution I *

vortex

+ 200 ul solution II *

swirling 6-8 x

on ice 5 min

+ 150 ul solution III *

swirling 6-8 x

on ice 5 min

12000 rpm, 10 min, 4oC

take supernatan
+ 400 ul PCI (Phenol : Chloroform : Isoamilalkohol = 25 : 24 : 1)

vortex

12000 rpm, 5 min, 4oC

take supernatant (400 ul)
+ 2.5xvolume ethanol 100% (1 ml)
+ 0.1xvolume 3M Natrium Acetate (40 ul)

mixed

incubate -20oC, 1 h

12000 rpm, 10 min, 4oC

take pellet
+ 1 ml ethanol 70% cold

12000 rpm, 10 min, 4oC

take pellet

dry up

+ 25 ul TE or H2O

Purification of plasmid :
DNA (25 ul)
+ 5 ul RNAse A (0.1 ug/ul)
+ 20 ul ddH2O

incubate 37oC, 1 h

+ (PEG : NaCl)* : DNA
3 : 5
30 ul : 50 ul

incubate 30 min, on ice

10000 rpm, 10 min, 4oC

take pellet
+ 1 ml ethanol 70% cold

10000 rpm, 10 min, 4oC

take pellet

dry up

+ 20 ul TE

 

* Solution I   : 50 mM glucose ; 25 mM Tris-Cl (pH.8) ; 10 mM EDTA (pH.8) ; autoclaved and keep on -20 degree celcius

* Solution II (make freshly) : 0.2 N NaOH ; 1% SDS

Solution III : 5 M Potassium Acetate (60 ml) ; glacial acetic (11.5 ml) ; H2O (28.5 ml)

* PEG : NaCl :  20% PEG 6000 ; 2.5 M NaCl ; autoclaved

cDNA Synthesis Protocol

•November 29, 2009 • Tinggalkan sebuah Komentar

(use : TaKaRa cDNA PCR Library Kit Code #6119 and cDNA Synthesis Kit Cat. #6130)

1st strand cDNA synthesis
1. Prepare Master Mix for 1st strand cDNA (always on ice) :

5 x 1st strand synthesis buffer (#6130) = 2 ul
dNTP mixture (#6130) = 0.5 ul
RNA-se inhibitor (#6130) = 0.5 ul
Oligo dT-RA primer (#6119) = 1 ul
M-MLV Reverse Transcriptase* (#6130) = 0.5 ul
____________________________________________
Total = 4.5 ul

2. Prepare template RNA :

1 ug RNA samples + DEPC water (#6130)  total volume = 5.5 ul

heat at 65 oC , 5 min

on ice

add Master Mix (4.5 ul) to samples

mix well

put the samples on Thermal Condition

3. Thermal Condition :

Room temperature, 10 min

42 oC, 1 h

80 oC, 5 min

2nd strand cDNA synthesis

4. Prepare Master Mix for 2nd strand cDNA :

Reactan 1st strand cDNA = 10 ul
5 x 2nd strand synthesis buffer (#6130) = 15 ul
dNTP mixture (#6130) = 1.5 ul
DEPC water (#6130) = 44.5 ul
____________________________________________
Total = 71 ul

5. Add E.coli DNA polymerase I (#6130) = 1 ul
6. Add E.coli RNAse H / DNA ligase mixture (#6130) = 1 ul


Thermal Condition :
16 oC, 2 h
70 oC, 10 min

Add T4 DNA polymerase I (#6130) = 2 ul

incubate on 37 oC, 10 min

Add Stop Solution (#6119) = 6 ul

purification of 2nd strand cDNA

Purification of 2nd strand cDNA

Samples 2nd strand cDNA (81 ul)
+ PCI (25:24:1) equal volume (81 ul)

mix well by vortex

15000 rpm, 5 min, 4 oC

take supernatant into new tube
+ CI (24:1) equal volume

mix well by vortex

15000 rpm, 5 min, 4 oC

take supernatant into new tube
+ ammonium acetate 4M (#6119) equal volume
+ isopropanol equal volume

keep on -20 oC, 1 h

mix gently (no vortex)

15000 rpm, 5 min, 4 oC

take pellet
+ 1 ml 70% ethanol (washing)

15000 rpm, 5 min, 4 oC

dry up

+ 5 ul DEPC water (#6130)

ligation of Cassette Adaptor

Ligation of Cassette Adaptor
purification of 2nd strand cDNA samples
+ 2 ul CA (Cassette Adaptor) (#6119)
+ 6 ul ligation solution II

mix well

+ 12 ul ligation solution I

mix well

incubate on 16 oC, 30 min

+ 25 ul ammonium acetate 4M (#6119) (equal volume)
+ 50 ul isopropanol (equal volume)

keep on -20 oC, 30 min

15000 rpm, 5 min, 4 oC

take pellet
+ 1 ml 70% ethanol (washing)

15000 rpm, 5 min, 4 oC

dry up

+ 30 ul DEPC water (#6130)

keep on -20 oC

Membuat cDNA Library ~ prinsip dasar

•November 29, 2009 • Tinggalkan sebuah Komentar

Pada dasarnya membuat cDNA Library (pustaka DNA) itu menggunakan mRNA. Jadi kita mengisolasi RNA terlebih dahulu dari sampel kita. RNA yang kita isolasi harus mengandung Poli (A)+ , jadi sebelum kita membuat cDNA Library hendaknya dicek terlebih dahulu dengan elektroforesis RNA (salah satu yang membedakan mRNA dengan RNA lain adalah mRNA memiliki Poli (A)+ ~ sekedar mengingatkan, mRNA hanya dipunyai oleh jasad tingkat tinggi). Dan satu hal lagi, pada saat kita kerja membuat cDNA, tidak boleh terkontaminasi oleh RNAse, karena RNAse dapat menghilangkan RNA sampel kita.

Supaya mempermudah dan hasilnya bagus, kita biasanya membuat cDNA dengan Kit (sudah disediakan dan dijual oleh pabrik). Di lab saya menggunakan produk TaKaRa cDNA synthesis kit manual (Cat #6130) dan TaKaRa cDNA PCR Library Kit manual (code #6119)

Dalam membuat cDNA (DNA komplemen) ada 2 step yang penting, yaitu membuat 1st strand cDNA dan 2nd strand cDNA.

Pada waktu pembuatan 1st cDNA, RNA harus dalam keadaan lurus. Maka dari itu biasanya sebelum dibuat proses pembuatan cDNA sintesis, RNA terlebih dahulu dipanaskan pada suhu 65 derajat, 5 menit, kemudian masukkan dalam es. cDNA disintesis dari mRNA dengan reverse transcriptase dan menggunakan oligo dT sebagai primer (2 komponen ini sangat penting dalam pembuatan 1st strand cDNA). Yang lainnya adalah buffer-buffer, seperti 1st strand synthesis buffer Dalam hal ini konsep yang dipakai adalah proses transkripsi pada DNA. Biasanya kita juga menyebutnya proses ini adalah RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR). Di sini juga kita inkubasi pada suhu yang berbeda. Pada kit yang saya pakai, (1) suhu ruang pada 10 menit (preinkubasi) ; (2) 42 derajat pada 1 jam (proses pembuatan cDNA) ; (3) 80 derajat pada 5 menit (mematikan reverse transkriptase).

Kemudian, proses selanjutnya adalah sintesis 2nd strand cDNA dari 1st cDNA yang telah terbentuk. Tapi sebelumnya ada proses penghancuran RNA (tapi RNA tidak hancur semua) dan meninggalkan potongan RNA kecil-kecil, oleh RNAse H. Potongan RNA kecil-kecil ini nantinya bisa dijadikan primer. Pada proses ini solution yang dibutuhkan adalah DNA polimerase untuk sintesis 2nd strand cDNA, RNA-se H (untuk memotong RNA), T4 DNA polimerase (untuk bluting / meratakan ujung DNA yang tidak rata. karena setelah dibentuk double-stranded DNA, kedua ujung cDNA tidak rata).

Setelahnya, dilakukan purifikasi cDNA dan ligation of cassette adaptor (jadi cDNA-nya dipasang adaptor).

 

•Juli 23, 2008 • 1 Komentar

UJI KETAHANAN BERBAGAI HIBRIDA TANAMAN KUBIS (Brassica oleracea cv. capitata L.) TERHADAP INFEKSI JAMUR PATOGEN

Y.Sri Wulan Manuhara1),Ni Nyoman Tri Puspaningsih2),Sri Puji Astuti W.1),Widhi Dyah Sawitri.1)

1)Departemen Biologi Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga

2)Departemen Kimia Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga

——————————————————————————————————————————————-

ABSTRAK

Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan ketahanan berbagai hibrida tanaman kubis asal impor dan lokal terhadap infeksi jamur patogen dilihat dari besarnya nekrosis daun dan profil proteinnya. Sebagai bahan penelitian digunakan 6 jenis hibrida tanaman kubis yaitu hibrida K-K Cross, Ishito, Sinjuku, Gloria osena, Rotan osena, dan Investor, sedangkan jamur patogen yang digunakan adalah Penicillium sp., Mucor sp., Aspergillus sp dan Alternaria sp. Uji ketahanan dilakukan dengan cara menginokulasikan miselium-disk (diameter 5 mm) yang telah ditumbuhi jamur patogen di permukaan atas daun tanaman kubis. Tanaman kemudian dipelihara dalam keadaan lembap dan gelap. Tiga hari sesudah inokulasi diukur diameter nekrosis yang terjadi pada daun. Untuk mengetahui profil proteinnya dilakukan SDS-PAGE. Hasil penelitian menunjukkan tingkat ketahanan enam hibrida tanaman kubis terhadap infeksi berbagai macam jamur berbeda-beda, tetapi berdasarkan besarnya nekrosis akibat infeksi jamur diperoleh bahwa tanaman kubis lokal (Gloria osena, Rotan osena dan Investor) lebih tahan dibanding tanaman kubis impor (K-K Cross, Ishito, Sinjuku). Profil protein dari enam hibrida tanaman kubis yang digunakan dalam penelitian ini sama, yaitu terdiri dari enam pita dengan berat molekul 200 kDa, 150 kDa, 100 kDa, 50 kDa, 40 Da, 30 kDa. Di antara pita protein tersebut terdapat pita dengan berat molekul 33 kDa yang menunjukkan berat molekul dari protein enzim -1,3-endoglukanase.

Keywords: Brassica oleracea cv. capitata L., ketahanan tanaman, infeksi, jamur patogen

My Script (English)

•Juli 23, 2008 • 2 Komentar

Widhi Dyah Sawitri, 2008. Identification of β-1,3-endoglukanase Protein in Cabbage Cultivars (Brassica oleracea var. capitata L.) after Infected Some Pathogen Fungal. The Script is under guidance by Dr. Y. Sri Wulan Manuhara, M.Si and Dra. Sri Puji Astuti Wahyuningsih, M.Si. Department of Biology, Faculty of Science and Technology, Airlangga University.

—————————————————————————————————————————————–

ABSTRACT

Cabbage (Brassica oleracea var. capitata L.) is one of agricultural important crop that has some cultivars. Productivity of the crop is affected by some factors. One of disadvantage that can decrease the productivity is presence of disease caused by fungal pathogen infection. Some cabbage cultivars had been identified to possess defence system for pathogen infection. β-1,3-endoglukanase is one of enzyme which has a function to defence against pathogen fungal infection. This enzyme catalyzes the hydrolysis of β-1,3-glukan which is a major component of cell wall of most fungi and it has a molecule weight of 33 kDa. The hydrolyze yields elicitors and it then induces production of phytoalexins antifungal. This research was conducted for early identification of β-1,3-endoglukanase protein based on its molecular weight in SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphonat Polyacrylamide Gel Electrophoresis). The identification was carried out after cabbage cultivars (KK Cross, Gloria Osena, Ishito 3, Shinjuku, Rotan Osena, dan Investor 369) were infected by four fungal pathogens that are Penicillium sp., Mucor sp., Aspergillus sp., and Alternaria sp. One week after infection, the presence of necrotic on surface of leaves was observed. Result of necrotic observation showed that some of the cabbage cultivar was susceptible to the fungal pathogen infections, that were KK Cross and Shinjuku cultivars. However, Gloria Osena, Ishito 3, Rotan Osena, and Investor 369, were more resistance to fungal pathogen infection than KK Cross and Shinjuku. The SDS-PAGE analysis showed that the cultivars which were infected by Alternaria sp. and Aspergillus sp. could not produce β-1,3-endoglukanase protein band. These results showed that cabbage cultivars were susceptible when they were infected by Alternaria sp. and Aspergillus sp.

Keywords : β-1,3-endoglukanase, Brassica oleracea var. capitata L., pathogen fungal, necrotic, SDS-PAGE, resistance

 
Ikuti

Get every new post delivered to your Inbox.